Test PCR

Maximilian Reindl študoval chémiu a biochémiu na LMU v Mníchove a od decembra 2020 je členom redakčného tímu Oboznámi sa s vami s témami lekárskej, vedeckej a zdravotnej politiky, aby boli zrozumiteľné a zrozumiteľné.

Ďalšie príspevky od Maximiliana Reindla Všetok obsahu kontrolujú lekárski novinári.

Testy PCR sa stali nepostrádateľnou súčasťou modernej medicíny a molekulárnej diagnostiky. Pretože sú také presné, sú považované za „zlatý štandard“. Môžu byť použité v širokej škále aplikácií, od detekcie patogénov až po skríning dedičných chorôb - t.j. všade tam, kde je potrebné spoľahlivo odhaliť aj tie najmenšie stopy dedičného materiálu. Tu zistíte, prečo je test PCR taký presný, kde sa používa a ako detailne funguje.

Čo je to test PCR?

Test PCR je laboratórna metóda z molekulárnej biológie a medicíny. Test sa používa na priamu detekciu - a charakterizáciu - genetického materiálu. Experti považujú metódu PCR za ľahko vykonateľnú, univerzálne použiteľnú a robustnú.

V laboratóriu sa test PCR skladá z dvoch krokov. V prvom kroku sa existujúci genetický materiál reprodukuje pomocou polymerázovej reťazovej reakcie alebo skrátene PCR. Takýmto spôsobom je možné skúmať najmenšie stopy DNA. To je tiež dôvod, prečo sú testy PCR také citlivé.

V druhom kroku je genetický materiál oddelený, „triedený“ a charakterizovaný podľa jeho vlastností. Takže je určená jemná štruktúra DNA.

Existuje mnoho možných použití: Lekári pomocou testu PCR skúmajú napríklad stery na koronavírusy, darovanie krvi na HIV alebo vyšetrujú novorodencov na možné dedičné choroby. Bakteriálne infekcie - napríklad s pôvodcom tuberkulózy - alebo parazitárne infekcie (malária) sa dajú objasniť aj pomocou PCR.

Pomáhajú aj v súdnom lekárstve pri usvedčovaní páchateľov na základe ich genetického odtlačku prsta alebo sa používajú ako testy otcovstva.

Všetky tieto aplikácie sú zhrnuté pod pojmom molekulárna diagnostika. PCR tak nachádza praktické uplatnenie vo výskume, diagnostike a kriminalistike ďaleko za hranicou detekcie patogénu Sars-CoV-2.

(Corona) PCR test verzus rýchly test PCR

Vyhodnotenie testu PCR zvyčajne prebieha v špecializovanom laboratóriu. To znamená, že materiál vzorky sa tam pošle a preskúma. Výsledok sa zvyčajne dostaví o niekoľko dní neskôr.

Rôzne startupy (GNA Biosolutions, Spindiag) nedávno predstavili nové typy mobilných testovacích zariadení. Na to tiež získali špeciálne schválenia od Federálneho inštitútu pre lieky a zdravotnícke pomôcky (BfArM). S pomocou týchto mobilných testovacích zariadení PCR by bol test PCR možný aj bez špecializovaného laboratória.

Tento prístup má veľký potenciál, pretože spoľahlivý výsledok testu by mohol byť k dispozícii do niekoľkých hodín priamo na mieste, kde bola vzorka odobratá (testovacie centrum).

Do akej miery budú v praxi tieto systémy rýchleho testu PCR prevládať, zatiaľ nemožno posúdiť. Tiež nie je zatiaľ známe, ako rýchlo budú testovacie centrá dodávané s týmito zariadeniami plošne.

V dohľadnej budúcnosti sa preto budú naďalej vykonávať „pravidelné“ laboratórne testy PCR, ktoré spôsobujú určité oneskorenie medzi odberom vzoriek a výsledkom testu.

Ako spoľahlivý je test PCR?

PCR je osvedčená metóda detekcie v molekulárnej diagnostike a medicíne. Je považovaný za takzvaný zlatý štandard s veľmi nízkou chybovosťou. Testy sa vyznačujú predovšetkým veľmi vysokou citlivosťou a špecifickosťou.

Citlivosť znamená spoľahlivosť, s ktorou test nájde genetický materiál, ktorý sa má detegovať.

Špecifickosť znamená istotu, s ktorou test stanoví, že príslušný genetický materiál nie je vo vzorke prítomný.

Kedy fungujú testy PCR v prípade infekcie Sars CoV-2?

Test PCR spravidla detekuje korónovú infekciu dva až tri dni pred a do 20 dní po nástupe symptómov. Aj keď sú infikovaní ľudia úplne bez symptómov, test funguje v kritickom časovom období, keď môžu infikovať ostatných.

V individuálnych prípadoch je dôkaz toho dokonca možný 60 dní po objavení sa symptómov ochorenia.

Prvý deň po korónovej infekcii môže byť test PCR tiež negatívny, aj keď je prítomná infekcia. V takom prípade v čase testu na rozmazanie nebolo v hrdle dostatok vírusov. Ak však existuje dôvodné podozrenie na infekciu, lekári zvyčajne v nasledujúcich dňoch vykonajú ďalší test PCR.

možné zdroje chýb

Chybovosť v procese kopírovania DNA je v praxi zanedbateľná. Aj keď DNA polymerázy nikdy nefungujú správne, v procese testovania PCR sotva zohrávajú úlohu.

V praxi možné zdroje chýb spočívajú v procese vzorkovania: Je preto dôležité, aby náter robil vyškolený zdravotnícky personál. Vzorky slín a kloktadla by mohli znížiť presnosť, pretože tu dochádza k účinkom riedenia.

Ako funguje test PCR?

Test PCR vykonáva napríklad rodinný lekár alebo v špeciálnych testovacích centrách. Lekári alebo vyškolení zdravotnícki pracovníci najskôr odoberú vzorku. Na test sa zvyčajne odoberie tampón z horných dýchacích ciest. Obvykle má formu tampónu z úst alebo nosa a hrdla.

Možné je aj kloktanie oplachovým roztokom. Vzorka krvi je atypická na detekciu koróny - ale je rozšírená napríklad pri skríningu novorodencov.

Bez ohľadu na typ odobratej vzorky sa genetický materiál nachádza na vatovom tampóne, v plákacom roztoku alebo v kvapke krvi. Tento materiál vzorky je odoslaný do laboratória, kde je izolovaný a purifikovaný.

Test PCR je potom rozdelený do dvoch krokov:

• PCR: V tomto kroku sa znásobí množstvo pôvodného genetického materiálu.
• Elektroforéza: V druhom kroku sú segmenty genómu „triedené“ podľa veľkosti. Takto je možné charakterizovať vzorku - určí sa jemná štruktúra genetického materiálu.

Krok 1: PCR - „Polymerázová reťazová reakcia“

„PCR“ je prvým z dvoch pracovných krokov: Tu sa znásobí množstvo existujúcej počiatočnej DNA. Pretože len vtedy, keď je genetický materiál k dispozícii v dostatočnom množstve, je možné ho skúmať. Väčšinou je to ľudská DNA; testy na koronavírus sú podľa toho vírusová RNA.

Skratka PCR je anglický výraz „Polymerase Chain Reaction“.

Čo je potrebné pre PCR?

Počiatočná DNA je umiestnená v reakčnej nádobe so špeciálnymi látkami. Existujúci genetický materiál slúži ako templát, ktorý sa kopíruje za prítomnosti určitých enzýmov (Taq polymeráza) a určitých základných stavebných blokov DNA.

Proces kopírovania prebieha v niekoľkých - opakujúcich sa - cykloch (cykloch).

Konkrétne sa kombinujú tieto látky:

• Počiatočná DNA: materiál vzorky, ktorý sa má replikovať.
• Základné stavebné bloky DNA: Ide o nukleobázy adenín, tymín, cytozín a guanín.
• DNA polymeráza: Enzým, ktorý spája jednotlivé stavebné bloky DNA za vzniku dobre definovaného vlákna DNA. Novo získaný prameň je zrkadlovým (komplementárnym) obrazom pôvodného východiskového materiálu.
• Pufrovací roztok: Polymerázová reťazová reakcia prebieha vo fyziologickom tlmivom roztoku. To zaisťuje podmienky podobné tým, ktoré sa nachádzajú v ľudských bunkách. Tento roztok udržuje stabilné pH a obsahuje aj ióny horčíka. Tieto kontrolované podmienky sú nevyhnutné na zaistenie funkčnosti DNA polymerázy.
• Priméry: Skladajú sa zo 16 až 24 párov báz a slúžia ako štartovacia pozícia a štartovací signál. Priméry ukazujú DNA polymerázu, v ktorom bode (počiatočnej DNA) začína proces kopírovania.

Ako prebieha test PCR?

Pretože všetky látky potrebné na PCR sú teraz v reakčnej nádobe, môže sa začať samotný proces kopírovania genetického materiálu. Toto sa iba spustí, ovláda a opäť zastaví teplotou.

Reakčná nádoba sa následne cielene zahrieva alebo chladí na rôzne teploty. To sa vykonáva špeciálnym zariadením - takzvaným tepelným cyklovačom. Celková reakcia trvá asi jednu až dve hodiny.

Jednotlivé kroky cyklu PCR sú:

• Denaturácia dvojvlákien DNA: Vzorka sa zahreje na približne 90 stupňov Celzia. Výsledkom je, že pôvodné dvojvlákno DNA sa rozpadne na dve oddelené (komplementárne) jednoduché vlákna.
• Pripojenie základného náteru: Teplota sa zníži na mierne pod 60 stupňov Celzia. V dôsledku toho sa priméry (dopredné priméry, reverzné priméry) pripájajú k definovaným polohám na zodpovedajúcich jednotlivých vláknach DNA.
• Rozšírenie: Teplota sa zvýši na mierne nad 70 stupňov Celzia. DNA polymeráza teraz začína svoju prácu v tomto teplotnom optimáli. Pripája sa k polohám primérov a krok za krokom rozširuje pôvodné jedno vlákno DNA, až kým nie je k dispozícii presná (komplementárna) kópia (syntéza DNA).

Po dokončení cyklu sa teplota opäť zvýši na približne 90 stupňov Celzia - cyklus sa začína odznova.

Použitím metódy PCR je možné sekvencie DNA replikovať až do približne troch párov kilobáz (kbp). To zodpovedá približne 3 000 základným stavebným blokom DNA spojeným do „reťazca“. Na porovnanie: ľudský genóm uchováva plány a informácie o prevádzke bunky v približne troch miliardách párov báz - genóm koronavírusu na druhej strane pozostáva z 30 000 párov báz. Test PCR je možné použiť iba na reprodukciu a vyšetrenie krátkych úsekov celkovej DNA.

Zásadné sú priméry

Voľba primerov je pre proces PCR rozhodujúca. V diagnostike Sars-CoV-2 sa napríklad používa niekoľko primérov (multiplexná PCR).

Testy Corona PCR hľadajú tri rôzne vírusové gény: Celková špecificita sa zvyšuje na takmer 99,99%. To znamená, že pri tejto vysokej miere úspešnosti existuje iba jeden falošne pozitívny test na 10 000 vyšetrení (ak je vzorka odobratá správne).

Koľko kopírovaného genetického materiálu je teraz?

Predpokladajme, že po prvom cykle existujú dve identické dvojvlákna DNA.

Po každom cykle sa množstvo (kopírovaného) genetického materiálu zdvojnásobí. Množstvo DNA teda exponenciálne rastie.

Inými slovami: po druhom cykle sú štyri identické dvojvlákna - po treťom cykle osem dvojvlákien - po štvrtom cykle 16 dvojvlákien a po piatom cykle už 32 dvojvlákien.

Lekári zvyčajne tento proces opakujú asi dvadsať až tridsaťkrát.

Metaforicky povedané to znamená: Aj keď sa vo vzorke na začiatku nachádzalo iba jedno dvojvlákno DNA, po dvadsiatich cykloch už bude v reakčnej nádobe milión rovnakých kópií.

Čo znamená hodnota Ct?

Počet dokončených cyklov PCR je uvedený vo forme takzvanej hodnoty Ct. „Ct“ je odvodené z anglického výrazu „cycle threshold“. Táto hodnota Ct umožňuje urobiť vyhlásenie o množstve hľadaného genetického materiálu.

Pri nízkej hodnote Ct 20 je veľa počiatočného genetického materiálu. Ak je však hodnota Ct vysoká - približne 30 cyklov - existuje zodpovedajúcim spôsobom málo DNA. Cyklus PCR preto musí prebiehať častejšie.

Krok 2: Elektroforéza „Zoradenie podľa veľkosti“

Nakoniec, ak existuje dostatok „obohateného“ genetického materiálu, môže dôjsť k tomu, čo je známe ako elektroforéza. Vedci používajú určitú vlastnosť DNA: jej elektrický náboj.

Jednotlivé stavebné bloky DNA sú navzájom prepojené (negatívne) nabitou kostrou cukrového fosfátu. Čím dlhšia je určitá sekvencia DNA, tým vyšší je jej elektrický náboj.

Ak je genetický materiál umiestnený do špecifického nosičového média (agarózy) a je použité elektrické napätie, segmenty DNA sa začnú pohybovať kvôli svojmu náboju. Pretože dlhší úsek DNA cestuje rýchlejšie ako kratší fragment, delia sa podľa veľkosti.

Týmto spôsobom je možné skúmať a charakterizovať genetický materiál. V praxi sa neznáma vzorka so známym odkazom zvyčajne aplikuje na „štartovaciu čiaru“ a po určitom časovom období sa navzájom porovná.

Ak je „rýchlosť migrácie“ pre obe sekvencie rovnaká, znamená to: Detekcia je veľmi pravdepodobne pozitívna - hľadaný gén je obsiahnutý vo vzorke.

Špeciálny prípad koronavírusu: príprava vzorky a RT-PCR

Detekcia patogénu pre koronavírus je špeciálny prípad. Sars-CoV-2 je jedným z takzvaných RNA vírusov. To znamená, že genóm Sars-CoV-2 je vo forme RNA (ribonukleovej kyseliny).

RNA sa líši od DNA iba niekoľkými spôsobmi. Okrem iného je dostupný ako jednovláknový a je založený na cukrovej ribóze namiesto 2 "deoxyribózy. Nukleobázový tymín bol tiež nahradený uracilom ako štvrtou bázou.

Táto vírusová RNA musí byť „prepísaná“ do DNA pred pravidelným testom PCR. Tento proces sa nazýva reverzná transkripcia (RT) - odtiaľ pochádza termín RT -PCR. V priebehu tohto procesu sa získa jedno vlákno cDNA („komplementárna DNA“). V ďalšom kroku je jediné vlákno cDNA doplnené druhým, zrkadlovo obráteným vláknom DNA.

Na konci prípravy vzorky je dvojvlákno DNA, ktoré zodpovedá pôvodnému plánu RNA vírusu: Ako templát v teste PCR je teraz možné použiť iba toto dvojvlákno.

Ako dlho trvá, kým sa dostaví výsledok?

Po odoslaní vzorky do laboratória zvyčajne dostanete výsledok po jednom alebo dvoch pracovných dňoch.V testovacích centrách, ktoré často skúmajú vzorky na mieste, to môže trvať iba niekoľko hodín. Časové obdobie do značnej miery závisí od príslušného testovacieho centra a jeho logistiky.

Napriek zložitým pracovným procesom sú moderné laboratóriá schopné vykonávať testy PCR s vysokou priepustnosťou. S implementáciou pomáhajú špeciálne automatizované zariadenia.

Test PCR je stále považovaný za pomerne „pomalú“, ale o to spoľahlivejšiu detekčnú metódu.

Čo sa stane, ak je výsledok pozitívny?

Ak je vzorka odobratá správne, pozitívny test PCR znamená, že testovaná osoba je veľmi pravdepodobne infikovaná Sars-CoV-2.

Ak vám bolo pomocou testu PCR potvrdené, že ste infikovaní koronavírusom, ministerstvo zdravotníctva dostane od príslušného laboratória správu o pozitívnom výsledku testu. V takom prípade ministerstvo zdravotníctva nariadi izoláciu alebo karanténu.

Som automaticky nákazlivý, ak dostanem pozitívny test PCR?

Väčšinou áno. Ale nie vždy. Výsledok testu PCR by mal byť vždy interpretovaný v kontexte. Pozitívny test predovšetkým znamená, že máte v sebe vírusový materiál.

Ak ste nedávno trpeli ochorením Covid 19 (niekoľko dní), test PCR môže byť stále pozitívny - aj keď ste už opäť zdraví. Toto je zvláštny prípad a negatívna stránka veľmi citlivého testu, pretože môže detegovať aj fragmenty vírusu, ktorý sa nemôže reprodukovať.

Niekedy je užitočný doplnkový test na protilátky

V takýchto prípadoch test protilátok poskytuje istotu, ktorá zaisťuje platnosť testu PCR. Najlepšie je prediskutovať to so svojim lekárom. Môžu vám pomôcť správne interpretovať výsledok testu PCR.

Čo robiť, ak je výsledok negatívny

Negatívny výsledok testu PCR znamená s vysokou pravdepodobnosťou, že ste pri odobratí vzorky nezasiahli Covid-19, a preto v súčasnosti nie sú nákazlivé. Môžete však byť v počiatočných štádiách infekcie.

Korónovú infekciu je zvyčajne možné zistiť až od druhého alebo tretieho dňa po infekcii. Výsledkom teda nie je lístok zadarmo. Preto by ste mali aj naďalej dodržiavať vzdialenosti a hygienické pravidlá a naďalej používať masku FFP2 - pre seba aj pre ochranu ostatných.

PCR test u detí

Pediatrický test PCR sa nelíši od testu PCR pre dospelých. Odber vzoriek aj interpretácia výsledkov sa vzťahujú na deti i dospelých.

Aké sú riziká testu PCR?

Test PCR nepredstavuje žiadne fyzické riziká. Len vzorkovanie nasofaryngeálnym tampónom niektorí ľudia vnímajú ako otravné alebo nepríjemné.

Čo stojí test PCR?

Všetky náklady, ktoré vzniknú pri teste PCR, budú kryté, ak vám takýto test schvália ošetrujúci lekári alebo zdravotnícke oddelenie. Náhrada nákladov sa zvyčajne zvažuje, ak už máte vlastné príznaky alebo ste mali priamy kontakt s infikovanými ľuďmi.

Aj v prípade pozitívneho rýchleho alebo vlastného testu máte nárok na bezplatný test PCR.

Poznámka: Ak ste sa doma otestovali a dosiahli ste pozitívny výsledok, mali by ste sa ihneď telefonicky dohodnúť na stretnutí s rodinným lekárom. Váš ošetrujúci lekár s vami prediskutuje ďalší postup telefonicky.

Alternatívne je najlepšie zavolať na číslo 116 117 a zaregistrovať sa na test PCR. Do potvrdzujúceho testu by ste v ideálnom prípade mali zostať doma, aby ste chránili seba aj ostatných.

Tagy:  prvá pomoc laboratórne hodnoty túžba mať deti